76 de ampicilina

+

Ampicilina (Biología Molecular) Ampicilina (D -. A-aminobencilpenicilina Fig 1) es un miembro de una familia creciente de agentes antimicrobianos conocidos como las penicilinas semisintéticas. Las penicilinas semisintéticas son derivados del producto natural, el ácido 6-aminopencillanic, que han sido modificados químicamente deliberadamente (1). Las modificaciones químicas se introducen para crear nuevos compuestos con propiedades deseables específicas. En el caso de la ampicilina, la adición de los resultados aminobencilo de cadena lateral en un producto con una resistencia aumentada a pH ácido. Por lo tanto, la ampicilina es médicamente significativa, ya que fue la primera penicilina, para administrarse por vía oral en la práctica quimioterapéutico. Además, ampicilina muestra un espectro antibacteriano más amplio que el hacer las penicilinas de origen natural y es eficaz contra muchas especies bacterianas gram-negativas. El componente de la membrana externa de la pared celular bacteriana Gram-negativa representa una barrera de permeabilidad a muchos antibióticos, incluyendo las penicilinas naturales (2). El amplio espectro de actividad y el bajo costo relativo de ampicilina han convertido en una herramienta muy valiosa en la biología molecular y la genética para el estudio de organismos modelo Gram-negativas, tales como Escherichia coli y Haemophilus influenzae. Las aplicaciones que emplean la ampicilina se resumen a continuación. Figura 1. Estructura de ampicilina. La primera aplicación de la penicilina en la genética era para la selección de mutantes auxotróficos de E. coli (3, 4). Esta técnica, la selección de la penicilina, se basó en el hecho de que la penicilina mata a las bacterias en crecimiento activo solamente, mientras que las bacterias son la penicilina nongrowing tolerantes (ver la penicilina). Aunque bencilpenicilina (penicilina G) se empleó en los estudios originales que describen esta técnica, ampicilina, sería mucho más eficaz para este propósito debido a su amplio espectro. Los biólogos moleculares han explotado ampliamente elementos genéticos que codifican b-lactamasa (ver Proteínas de Unión a la penicilina), especialmente la enzima designada TEM-1. TEM-1 es un b-lactamasa de amplio espectro que confiere resistencia eficaz de alto nivel a las penicilinas (5). El gen que codifica TEM-1 se incorporó en los primeros vectores de clonación del plásmido (6) y ha sido ampliamente utilizado en los vectores de clonación desde entonces. La ampicilina se ha usado rutinariamente para la selección y el mantenimiento de bacterias portadoras de plásmidos recombinantes que codifican b-lactamasa, y esto es, sin duda, su aplicación más común en biología molecular. Para este propósito, la ampicilina se incorpora en medios bacteriológicos a concentraciones finales que varían de aproximadamente 50 a 100 ug / mL. Para E. coli, estos niveles son aproximadamente 10 a 20 veces mayor que la concentración inhibitoria mínima (MIC) de ampicilina. La MIC se define como la concentración mínima de antibiótico que es necesaria para inhibir el crecimiento bacteriano. Cuando una mezcla de bacterias sensibles a la ampicilina y resistentes a la ampicilina se colocan en medios sólidos que contenían ampicilina, como para la selección de transformantes que llevan un plásmido codificado-b-lactamasa, no es raro encontrar grandes colonias formadas por bacterias resistentes a la ampicilina rodeados por una zona de colonias más pequeñas. Las bacterias resistentes a la ampicilina en las grandes colonias centrales producen y secretan b-lactamasa. La actividad de la b-lactamasa segregada crea una zona de disminución de la concentración de ampicilina alrededor de las colonias resistentes, y esto permite que las bacterias sensibles a la ampicilina en las proximidades de crecer. El crecimiento posterior de las bacterias sensibles a la ampicilina como resultado la formación de los llamados colonias satélites más pequeños. Las colonias satélites normalmente no representan un obstáculo importante en estos procedimientos, ya que las bacterias resistentes a la ampicilina deseadas se pueden purificar fácilmente por rayas en un medio que contiene ampicilina. Sin embargo, el problema de la formación de colonias por satélite se puede minimizar mediante la sustitución de carbenicilina, otro penicilina semisintética (véase la Fig. 1 en la penicilina) para la ampicilina en el medio de selección a una concentración de 50.100 ig / ml (7). Carbenicilina es menos susceptible a la hidrólisis por la b-lactamasa y por lo tanto es menos probable que la promoción de la formación de colonias por satélite. Se utiliza, por tanto, a menudo en lugar de ampicilina. El gen de b-lactamasa también se ha introducido en derivados formadoras de placa y defectuosas del bacteriófago de E. coli Mu (8). Estos fagos ampicilina seleccionable se han utilizado para la mutagénesis y para la construcción de fusiones lac en aplicaciones que se aprovechan de la capacidad de Mu para transponer al azar. El concepto de la mutagénesis de transposón se ha aplicado a los elementos genéticos transponibles que codifican b-lactamasas para la generación de fusiones de genes aleatorias que son directamente seleccionable con ampicilina (o carbenicilina). Por ejemplo, un derivado de Tn3 designado Tn3-HoHo1 (9) es un transposón que contiene lacZ-capaz de producir ambas fusiones de beta-galactosidasa de transcripción y traducción. A pesar de que fue desarrollado originalmente para los estudios de Agrobacterium tumefaciens, que ha sido adaptado para su uso en otros géneros bacterianos. B-lactamasa es una enzima periplásmica. Ha servido como un importante modelo para el estudio de la exportación de proteínas al periplasma bacteriano. Urbain et al. (10) han desarrollado recientemente una técnica para la cuantificación de la actividad de b-lactamasa en cultivos de E. coli que llevan plásmidos recombinantes que confieren resistencia a la ampicilina. Su ensayo implicó la determinación de la conversión de ampicilina a aminobenzylpenicilloic ácido en los extractos periplásmico de las células por cromatografía cuantitativa líquida de alto rendimiento (HPLC). El procedimiento puede ser útil para investigar el mecanismo de la translocación b-lactamasa. También puede resultar útil en estudios de expresión de la proteína. Por ejemplo, desde b-lactamasa se expresa constitutivamente a partir de plásmidos recombinantes a ampicilina seleccionable, su actividad podría servir como un estándar interno útil en los estudios de coexpresión de proteínas. B-lactamasa también se ha utilizado como herramienta genética para el estudio de proteínas de la membrana, y estas aplicaciones se basan en el hecho de que b-lactamasa es una proteína exportada (11, 12). Un vector plásmido que permite la construcción in vitro de fusiones de traducción entre un gen de interés, que codifica ya sea una proteína de membrana o una proteína exportada, y la forma madura (es decir, la forma exportada) de la TEM se ha descrito b-lactamasa (13 ). Los transformantes que llevan los plásmidos recombinantes con fusiones en marco son la ampicilina seleccionable. Esta técnica se puede utilizar para el análisis de señales de exportación de proteínas o para la determinación de la organización topológica de proteínas de membrana. Una estrategia para maximizar el rendimiento de la membrana y las proteínas exportadas basadas en este vector también se ha descrito (14). Es notable que la fosfatasa alcalina se ha usado ampliamente para el estudio de señales de exportación de proteínas y para el mapeo topológica de proteínas de la membrana (15). El sistema de b-lactamasa es una alternativa atractiva a la fosfatasa alcalina para estos fines (13, 14) (véase genes indicadores). Por ejemplo, fusiones de b-lactamasa son directamente seleccionable (con ampicilina), mientras que la identificación de las fusiones de fosfatasa alcalina se basa en la detección fenotípica. Por otra parte, sólo la forma periplásmico de la fosfatasa alcalina es enzimáticamente activa, mientras que tanto las formas citoplasmáticos y periplásmico de b-lactamasa están activos. En consecuencia, la localización celular de las fusiones b-lactamasa se puede determinar sobre la base de los niveles de resistencia a la ampicilina citoplásmica b-lactamasa confiere resistencia a la ampicilina sólo a una alta densidad celular, mientras que periplásmico b-lactamasa confiere resistencia a ampicilina a baja densidad celular. Como una extensión de estos estudios, Broome-Smith et al. (16) han construido un elemento de b-lactamasa transponible, designado TnblaM, que es equivalente al elemento transponible fosfatasa alcalina, TnphoA. Las fusiones de b-lactamasa construidos con TnblaM son directamente seleccionable con ampicilina, y esto es una gran ventaja sobre el sistema de la fosfatasa alcalina, que como ya se ha indicado se basa en el cribado fenotípico.